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大鼠凋亡相關(guān)因子配體(FASL)ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)使用說明書
試劑盒簡介
大鼠凋亡相關(guān)因子配體(FASL)ELISA試劑盒是一種用于體外定量檢測大鼠血清、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中FASL含量的實(shí)驗(yàn)工具。該試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)原理，具有高靈敏度、高特異性和良好的重復(fù)性?。
BS-3034大鼠凋亡相關(guān)因子配體(FASL)ELISA試劑盒
實(shí)驗(yàn)原理
本試劑盒基于雙抗體夾心法ELISA技術(shù)。預(yù)先包被的大鼠FASL抗體會與樣本中的FASL結(jié)合，再加入HRP標(biāo)記的檢測抗體形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物。經(jīng)過洗滌后加入TMB底物顯色，顏色的深淺與樣品中FASL濃度呈正相關(guān)。最后在450nm波長下測定吸光度(OD值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度?。
試劑盒組成
主要組分
酶標(biāo)包被板：預(yù)包被抗體的96孔或48孔微孔板(2-8℃保存)
標(biāo)準(zhǔn)品：通常為720pg/ml或40ng/ml濃度(2-8℃保存)
酶標(biāo)試劑：HRP標(biāo)記的檢測抗體(2-8℃保存)
顯色劑：TMB溶液(A液和B液分開保存，2-8℃避光)
終止液：2M硫酸溶液(2-8℃保存)
濃縮洗滌液：20倍或30倍濃縮(2-8℃保存)?
其他配件
封板膜：用于反應(yīng)過程中封閉微孔板
密封袋：用于保存未使用的酶標(biāo)板
說明書：詳細(xì)操作指南?
樣本處理要求
血清樣本
室溫血液自然凝固10-20分鐘
2000-3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘
仔細(xì)收集上清，避免溶血
如出現(xiàn)沉淀，需再次離心
短期可2-8℃保存48小時(shí)，長期需-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融?
血漿樣本
使用EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑
采集后30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘
收集上清，保存條件同血清?
組織勻漿
用預(yù)冷PBS(0.01M, pH7.4)沖洗組織，去除殘留血液
按1:9重量體積比加入PBS(含蛋白酶抑制劑)
冰上充分研磨，可超聲破碎或反復(fù)凍融輔助裂解
5000×g離心5-10分鐘，取上清檢測?
實(shí)驗(yàn)操作步驟
試劑準(zhǔn)備
將所有試劑平衡至室溫(約30分鐘)
配制洗滌液：蒸餾水按1:20或1:25稀釋濃縮洗滌液
標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋：按照說明書要求進(jìn)行系列倍比稀釋
酶標(biāo)工作液配制：臨用前按比例稀釋?
加樣與孵育
設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔
空白孔加樣品稀釋液，標(biāo)準(zhǔn)品孔加不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品，樣品孔加待測樣本
每孔加樣50-100μl，輕輕混勻
貼上封板膜，37℃孵育40-60分鐘?
洗滌
棄去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液(300μl)
靜置2分鐘后棄去，在濾紙上拍干
重復(fù)洗滌4-5次?
加酶標(biāo)抗體
每孔加入HRP標(biāo)記的檢測抗體工作液100μl
貼上封板膜，37℃孵育30分鐘
重復(fù)洗滌步驟?
顯色
每孔加入TMB顯色液100μl(臨用前A液1:1混合)
37℃避光顯色10-20分鐘(觀察顏色變化)
每孔加入終止液50-100μl終止反應(yīng)?
測定
終止反應(yīng)后30分鐘內(nèi)完成測定
酶標(biāo)儀450nm波長讀取各孔OD值
以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
根據(jù)樣品OD值計(jì)算FASL濃度，乘以稀釋倍數(shù)?
注意事項(xiàng)
實(shí)驗(yàn)前
不同批號試劑不可混用
試劑使用前應(yīng)充分混勻，避免產(chǎn)生氣泡
平衡至室溫后方可使用
準(zhǔn)備好所有所需器材，避免實(shí)驗(yàn)中斷?
實(shí)驗(yàn)中
嚴(yán)格控制孵育時(shí)間和溫度
加樣準(zhǔn)確，避免孔間交叉污染
洗滌津，防止非特異性結(jié)合
顯色時(shí)間可根據(jù)顏色深淺適當(dāng)調(diào)整?
實(shí)驗(yàn)后
未用完的酶標(biāo)板條應(yīng)立即放回密封袋保存
廢液應(yīng)按照實(shí)驗(yàn)室規(guī)定處理
數(shù)據(jù)及時(shí)記錄和分析?
結(jié)果分析
標(biāo)準(zhǔn)曲線
以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(X軸)，對應(yīng)OD值為縱坐標(biāo)(Y軸)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。推薦使用四參數(shù)邏輯(4-PL)曲線擬合，R2值應(yīng)≥0.99?。
計(jì)算
根據(jù)樣品OD值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相應(yīng)濃度，再乘以稀釋倍數(shù)即為實(shí)際濃度。若樣品OD值超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重新測定?。
保存條件
未開封試劑盒：-℃保存，有效期6個(gè)月
開封后試劑：按說明書要求保存，部分需周內(nèi)用完4]
常見問題解決
高背景
檢查洗滌是否充分
確認(rèn)封閉步驟是否到位
. 避免酶標(biāo)抗體濃度過高
縮短顯色時(shí)間]
低信號
. 檢查試劑是否失效
. 確認(rèn)孵育時(shí)間和溫度是否足夠
. 樣本中目標(biāo)蛋白濃度可能過低，需濃縮樣本]
標(biāo)準(zhǔn)曲線不佳
. 檢查標(biāo)準(zhǔn)品稀釋是否正確
2. 確認(rèn)酶標(biāo)儀功能正常
3. 避免顯色過度或不足]
注：以上資料僅供參考，如需完整版產(chǎn)品信息請咨詢品牌供應(yīng)商或技術(shù)老師。
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