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BS-4401 雞胰蛋白酶(trypsin)ELISA試劑盒
本試劑盒僅供研究使用，不用于臨床診斷。
1. 簡(jiǎn)介：
雞胰蛋白酶（Trypsin）是一種絲氨酸蛋白酶，在禽類(lèi)消化和生理過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（Sandwich ELISA）定量檢測(cè)雞血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清液或其他生物液體樣本中的胰蛋白酶濃度。
2. 實(shí)驗(yàn)原理：
本實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心法。
將特異性抗雞Trypsin抗體預(yù)包被在微孔板上。
加入樣本和標(biāo)準(zhǔn)品，其中的Trypsin會(huì)與孔板上的捕獲抗體結(jié)合。
洗板后，加入生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體，與Trypsin的另一位點(diǎn)結(jié)合，形成“抗體-抗原-抗體"復(fù)合物。
再次洗板后，加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的鏈霉親和素（Streptavidin），后者會(huì)與生物素特異性結(jié)合。
加入底物TMB顯色液，在HRP的催化下產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物，加入終止液后變?yōu)辄S色。
用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)量各孔的吸光度（OD值），其顏色深淺與樣本中的Trypsin濃度成正比。通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可計(jì)算出樣本中Trypsin的實(shí)際濃度。
（注：請(qǐng)于收到試劑盒后核對(duì)各組分?jǐn)?shù)量，并參照標(biāo)簽說(shuō)明進(jìn)行保存。）
| 組分名稱 | 規(guī)格 (96T) | 保存條件 |
|---|---|---|
| 預(yù)包被微孔板 | 12條×8孔 | 2-8℃干燥保存 |
| 雞Trypsin標(biāo)準(zhǔn)品 | 凍干粉或液體 | -20℃保存（按說(shuō)明書(shū)復(fù)溶或稀釋） |
| 樣本稀釋液 | 30 mL | 2-8℃保存 |
| 生物素標(biāo)記檢測(cè)抗體 | 10-15 mL | 2-8℃保存（避免光照） |
| HRP標(biāo)記的鏈霉親和素 | 10-15 mL | 2-8℃保存（避免光照） |
| 濃縮洗滌液 (20X) | 50 mL | 2-8℃保存（使用前需稀釋） |
| TMB底物溶液 | 10-15 mL | 2-8℃避光保存 |
| 終止液 (2M H?SO?) | 10-15 mL | 2-8℃保存 |
| 封板膜 | 4-6張 | 室溫 |
| 說(shuō)明書(shū) | 1份 | 室溫 |
酶標(biāo)儀（450 nm濾光片）
精密移液器及一次性吸頭
渦旋混合器
37℃恒溫孵育箱
洗板機(jī)或手動(dòng)洗板設(shè)備（多道移液器）
蒸餾水或去離子水
用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的試管、EP管
吸水紙
平衡室溫：將所有試劑（除標(biāo)準(zhǔn)品外）取出，平衡至室溫（18-25℃）約30分鐘后再使用。
配制洗滌液：將濃縮洗滌液（20X） 用蒸餾水或去離子水按 1:19 稀釋，即1份濃縮洗滌液加19份水，混勻后即為工作濃度洗滌液。
配制標(biāo)準(zhǔn)品：
若標(biāo)準(zhǔn)品為凍干粉：加入指定體積的樣本稀釋液進(jìn)行復(fù)溶，靜置片刻，輕輕渦旋混勻。此溶液為最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品（Stock）。
若標(biāo)準(zhǔn)品為液體：直接進(jìn)行系列稀釋。
按照說(shuō)明書(shū)要求，用樣本稀釋液進(jìn)行倍比稀釋，制備一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)（例如：1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.625 pg/mL）。通常設(shè)置7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)和一個(gè)零點(diǎn)（樣本稀釋液作為空白孔）。
稀釋樣本：根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)或文獻(xiàn)報(bào)道，用樣本稀釋液對(duì)未知樣本進(jìn)行適當(dāng)稀釋（如10倍、100倍稀釋）。建議初次實(shí)驗(yàn)設(shè)置多個(gè)稀釋度，以確保OD值落在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)。
總流程概要： 加樣 → 孵育 → 洗板 → 加檢測(cè)抗體 → 孵育 → 洗板 → 加酶結(jié)合物 → 孵育 → 洗板 → 顯色 → 終止 → 檢測(cè)
加樣：
設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣本孔和空白孔（Blank）。
標(biāo)準(zhǔn)品孔：加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品100 μL。
樣本孔：加入已稀釋的待測(cè)樣本100 μL。
空白孔：加入樣本稀釋液100 μL。
注意：每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)和樣本建議設(shè)2-3個(gè)復(fù)孔。
蓋上封板膜，在37℃下孵育90分鐘。
洗板：
小心揭掉封板膜，棄去孔內(nèi)液體。
每孔加滿工作洗滌液（約350 μL），靜置30秒后棄去，如此重復(fù)洗板3次。
最后一次洗板后，在吸水紙上拍干，確保無(wú)液體殘留。
加檢測(cè)抗體：
除空白孔外，每孔加入生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL。
蓋上新的封板膜，在37℃下孵育60分鐘。
洗板：
重復(fù)步驟2的洗板過(guò)程，共洗板3次。
加酶結(jié)合物：
每孔（包括空白孔）加入HRP標(biāo)記的鏈霉親和素100 μL。
蓋上新的封板膜，在37℃下孵育30分鐘（避免光照）。
洗板：
重復(fù)步驟2的洗板過(guò)程，共洗板5次（此步需更凈，減少非特異性結(jié)合）。
顯色：
每孔（包括空白孔）加入TMB底物溶液90 μL。
蓋上封板膜，在37℃避光條件下顯色15-20分鐘。期間密切觀察標(biāo)準(zhǔn)品孔的顏色變化（出現(xiàn)梯度藍(lán)色）。
終止：
當(dāng)最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品孔呈現(xiàn)明顯的藍(lán)色，且梯度良好時(shí)，每孔加入終止液50 μL。溶液顏色立即由藍(lán)變黃。
檢測(cè)：
在加入終止液后15分鐘內(nèi)，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。
設(shè)置：先用空白孔調(diào)零。
計(jì)算每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣本復(fù)孔的平均OD值。
以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)（X軸），對(duì)應(yīng)的平均OD值為縱坐標(biāo)（Y軸），在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上或用軟件（如Excel，選擇四參數(shù) logistic (4-PL) 曲線擬合）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
將樣本的平均OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出對(duì)應(yīng)的濃度（X值）。
重要：計(jì)算出的樣本濃度必須再乘以樣本的稀釋倍數(shù)，才能得到樣本中Trypsin的實(shí)際濃度。
安全第一：終止液為稀硫酸，具有腐蝕性，請(qǐng)佩戴手套和護(hù)目鏡操作。如不慎接觸皮膚，立即用大量清水沖洗。
試劑保存：未使用的板條應(yīng)立即放回帶有干燥劑的鋁箔袋中密封，2-8℃保存。TMB和酶結(jié)合物對(duì)光敏感，需避光保存。
操作規(guī)范：精確的移液和的洗板是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。避免交叉污染。
時(shí)效性：所有試劑應(yīng)在有效期內(nèi)使用。復(fù)溶后的標(biāo)準(zhǔn)品分裝凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融。
線性范圍：如果樣本OD值超出標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點(diǎn)，請(qǐng)?jiān)黾酉♂尡稊?shù)后重新檢測(cè)。
質(zhì)量控制：建議每次實(shí)驗(yàn)都運(yùn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線，并設(shè)置質(zhì)控樣本。
注：以上資料僅供參考，不作為實(shí)際數(shù)據(jù)，如需其他請(qǐng)咨詢技術(shù)老師或品牌供應(yīng)商。
試劑盒 本生一直視質(zhì)量控制為企業(yè)的生命，追求企業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力的不斷提升。公司在經(jīng)營(yíng)中始終秉承：遵紀(jì)守法，嚴(yán)于律己，寬仁以待，敢于承擔(dān)的企業(yè)精神作為標(biāo)準(zhǔn)，以過(guò)硬的質(zhì)量和優(yōu)良的服務(wù)來(lái)維護(hù)和拓展市場(chǎng)，較大限度的滿足客戶的需求。與客戶的共贏，是我們的發(fā)展目標(biāo)。本生!您信任的合作伙伴。我們?cè)概c您真誠(chéng)合作，共創(chuàng)美好的未來(lái)。
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