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人腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA檢測試劑盒實驗使用說明書
BS-0121人腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒
一、試劑盒簡介
本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)技術(shù)，專用于定量檢測人血清、血漿或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中腫瘤壞死因子α(TNF-α)的濃度。TNF-α是一種關(guān)鍵的細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)及細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。本試劑盒僅供科研使用，不可用于臨床診斷。
二、試劑盒組成
預(yù)包被抗體酶標(biāo)板?：96孔板，包被有抗人TNF-α單克隆抗體，用于捕獲樣本中的TNF-α。
凍干標(biāo)準(zhǔn)品?：2支，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，濃度范圍覆蓋檢測需求。
生物素標(biāo)記檢測抗體?：與TNF-α特異性結(jié)合，形成免疫復(fù)合物。
辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素(HRP-Streptavidin)?：與生物素標(biāo)記抗體結(jié)合，催化顯色反應(yīng)。
顯色底物(TMB)?：在HRP催化下產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物，酸終止后變黃。
終止液(2M溶液)?：終止顯色反應(yīng)，穩(wěn)定顏色。
濃縮洗滌液(20倍)?：用于洗滌酶標(biāo)板，去除未結(jié)合物質(zhì)。
樣本稀釋液?：稀釋樣本至適宜濃度。
封板膜?：防止蒸發(fā)和污染。
注：所有試劑需2-8℃避光保存，有效期6個月。
三、實驗前準(zhǔn)備
試劑平衡?：所有試劑及樣本使用前需室溫(18-25℃)平衡30分鐘，避免直接加熱。
標(biāo)準(zhǔn)品配制?：
每支凍干標(biāo)準(zhǔn)品加1mL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，室溫靜置10分鐘，輕柔混勻。
配制梯度：從原液(如2000pg/mL)開始，進(jìn)行系列稀釋(如1000→500→250→125→62.5→31.2→0pg/mL)，共7個濃度點，空白孔為0pg/mL。
洗滌液配制?：20mL濃縮洗滌液加580mL蒸餾水，混勻備用。
檢測抗體工作液?：臨用前將生物素標(biāo)記抗體用檢測稀釋液按1:100稀釋(如10μL抗體+990μL稀釋液)。
酶結(jié)合物工作液?：HRP標(biāo)記鏈霉親和素按1:100稀釋。
四、樣本處理
血清/血漿?：避免溶血，4℃保存不超過3天，-20℃長期保存避免反復(fù)凍融。檢測前離心去除顆粒物。
細(xì)胞培養(yǎng)上清?：離心去除細(xì)胞碎片，檢測前確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)。若樣本濃度過高，建議預(yù)實驗確定稀釋倍數(shù)。
五、操作步驟
加樣?：每孔加入100μL標(biāo)準(zhǔn)品或樣本，37℃孵育90分鐘。
洗滌?：棄去孔內(nèi)液體，每孔加400μL洗滌液，靜置1-2分鐘后甩干，重復(fù)3次。
加檢測抗體?：每孔加100μL生物素化抗體工作液，37℃孵育60分鐘。
洗滌?：同步驟2，重復(fù)3次。
加酶結(jié)合物?：每孔加100μL酶結(jié)合物工作液，37℃孵育30分鐘。
洗滌?：同步驟2，重復(fù)5次。
顯色?：每孔加90μL TMB底物，37℃避光孵育15分鐘。
終止反應(yīng)?：每孔加50μL終止液，立即測定OD值(450nm波長)。
六、注意事項
標(biāo)準(zhǔn)曲線異常處理?：
平直曲線：檢查標(biāo)準(zhǔn)品溶解是否充分、洗板是否凈、移液是否準(zhǔn)確。
高值樣本：建議稀釋后復(fù)測。
樣本處理?：
避免使用含NaN3的樣本，因NaN3抑制HRP活性。
細(xì)胞上清需離心后檢測，避免細(xì)胞碎片干擾。
關(guān)鍵控制點?：
每步孵育時間誤差不超過±5分鐘。
洗板時拍板力度適中，避免交叉污染。
顯色時間嚴(yán)格控制，避免過度反應(yīng)。
七、結(jié)果計算
以標(biāo)準(zhǔn)品濃度(pg/mL)為橫坐標(biāo)，OD450值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
樣本OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算濃度，若超出檢測范圍(如31.2-2000pg/mL)需稀釋后重測。
靈敏度：最小檢測濃度小于15pg/mL，板內(nèi)/板間變異系數(shù)<10%。
八、常見問題解答
問題現(xiàn)象 可能原因 解決方案
顯色過快 酶結(jié)合物過量 減少孵育時間或稀釋酶結(jié)合物
背景過高 洗滌不凈 增加洗滌次數(shù)至5次
重復(fù)性差 移液誤差 校準(zhǔn)移液器，使用多道加樣器
九、儲存條件
未開封試劑盒：2-8℃避光保存。
已配制試劑：標(biāo)準(zhǔn)品溶液建議現(xiàn)配現(xiàn)用，其他工作液4℃保存不超過7天。
注：以上僅供參考，本產(chǎn)品僅供科研使用，不作為實際數(shù)據(jù)，實驗需嚴(yán)格遵循說明或咨詢技術(shù)老師。
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